中藥大品種核心價值挖掘與品牌構(gòu)建(附典型案例)
來源: 作者: 時間:2018-6-21 閱讀:
中藥大品種二次開發(fā)研究是中藥創(chuàng)新研究的重要內(nèi)容,也是中藥現(xiàn)代化的重要任務(wù)之一,自“十一五”以來,國家科技部、國家發(fā)改委、國家中管局等對中藥大品種的二次開發(fā)給予高度重視,并列入國家重要科技規(guī)劃和專項之中,在2014年科技獎勵大會上,“中藥二次開發(fā)核心技術(shù)體系創(chuàng)研及產(chǎn)業(yè)化”項目獲國家科技進步一等獎。中藥大品種二次開發(fā)研究將是當前以致今后一個時期中藥創(chuàng)新研究的重要任務(wù)。
中藥大品種普遍存在基礎(chǔ)研究薄弱,藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機理不清楚,臨床作用特點不突出,質(zhì)量控制體系尚不完善,生產(chǎn)工藝落后,產(chǎn)品劑型單一、落后等問題。促進中藥制藥技術(shù)升級、培育中成藥大品種的最有效途徑是實施中成藥二次開發(fā)戰(zhàn)略。通過二次開發(fā)研究,一方面明確臨床定位,加強藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機制研究,科學(xué)地闡釋中成藥的有效性和安全性;另一方面通過提升中藥制藥工藝品質(zhì)及制藥過程質(zhì)量控制技術(shù)水平,大幅度提高中成藥質(zhì)量標準,建立科學(xué)、嚴格和完整的中成藥質(zhì)量保障體系,確保中成藥質(zhì)量均一可控。通過中成藥二次開發(fā),可實現(xiàn)“優(yōu)勝劣汰”,擴大優(yōu)質(zhì)品種的市場占有率,促使中藥大品種成批涌現(xiàn),推動中藥產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。
疏風(fēng)解毒膠囊為治療急性上呼吸道感染屬風(fēng)熱證的中藥大品種,由虎杖、連翹、板藍根、柴胡、敗醬草、馬鞭草、蘆根、甘草八味中藥組成,具有疏風(fēng)清熱,解毒利咽的功效。元胡止痛滴丸為治療頭痛、痛經(jīng)及脅痛的中藥大品種,由延胡索和白芷二味藥組成,具有理氣、活血、止痛的作用,用于氣滯血瘀的胃痛、脅痛、頭痛及月經(jīng)痛等。本文以疏風(fēng)解毒膠囊和元胡止痛滴丸為例,論述中藥大品種核心價值發(fā)掘與品牌構(gòu)建的思路、方法與研究實踐。
一、中藥大品種核心價值構(gòu)成
見圖1.
圖1 中藥大品種核心價值構(gòu)成分析
1科學(xué)價值
(1)闡釋中醫(yī)針對疾病的治法原理
中藥大品種是中醫(yī)理論的載體,是中醫(yī)臨床治療疾病的主要施用手段和形式。因此,大品種二次開發(fā)首先闡釋中醫(yī)針對疾病的治法原理,是對中醫(yī)理論及中藥的臨床運用原理進一步豐富和完善的過程。
(2)闡釋中醫(yī)理論的配伍原理
中藥大品種多為中藥復(fù)方制劑,而中藥復(fù)方的配伍原理是中醫(yī)理論的精髓,以中藥大品種為研究的模型藥物,通過配伍規(guī)律研究,是闡釋中醫(yī)藥配伍理論的可行路徑。
(3)闡明藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機理研究
中藥大品種是經(jīng)過多年臨床實踐,并通過大量臨床樣本檢驗證實的有效藥物,但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機理尚不完全清楚,通過二次開發(fā)研究,以現(xiàn)代科學(xué)方法、客觀指標和實驗證據(jù)闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機理,在此基礎(chǔ)上建立科學(xué)的質(zhì)量控制方法,并指導(dǎo)臨床實踐。
2技術(shù)價值
中藥大品種核心技術(shù)價值主要反映一下4個方面:
(1)基于中醫(yī)理論和多組分藥物評價技術(shù)。中藥是一個復(fù)雜體系,按中醫(yī)理論指導(dǎo)進行臨床運用,因此,其有效性、作用特點及適用人群的評價需具有針對性,尤其是反映中醫(yī)方-證對應(yīng)、病-證兼顧、功能和主治均具的藥效學(xué)模型尤為重要;同時,中藥的作用機理研究仍處于探索階段,系統(tǒng)生物學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、生物信息學(xué)等方法在闡釋中藥大品種作用機理方面發(fā)揮重要作用,通過中藥大品種二次開發(fā)研究為中藥復(fù)雜體系療效特點、作用機理及配伍和理性研究探索可行研究路徑、方法和技術(shù)手段。
(2)制藥工藝技術(shù)。中藥大品種二次開發(fā)研究的重要內(nèi)容之一就是對制藥過程的改造、優(yōu)化和技術(shù)升級,通過二次開發(fā),建立質(zhì)量溯源的工藝體系,實現(xiàn)工藝參數(shù)優(yōu)化、在線監(jiān)測等技術(shù)升級。
(3)中藥現(xiàn)代制劑和釋藥技術(shù)。制劑處方、工藝優(yōu)化和劑型改進也是中藥大品種二次開發(fā)的重要內(nèi)容,其中,引進和應(yīng)用適宜的釋藥技術(shù)和新型制劑技術(shù),并應(yīng)用與中藥復(fù)方的復(fù)雜體系,對于推動中藥現(xiàn)代制劑和釋藥技術(shù)的發(fā)展具有重要的意義。
(4)質(zhì)量控制技術(shù)。質(zhì)量標準提升研究是中藥大品種二次開發(fā)研究的重要內(nèi)容,通過質(zhì)量標準提升研究,建立可溯源的、與療效高度關(guān)聯(lián)的全程質(zhì)量控制系統(tǒng)和質(zhì)量標準,為中藥質(zhì)量控制提供可參照的模式和研究范例。
3臨床價值
主要體現(xiàn)在4個方面:
(1)通過二次開打研究,進一步評價、發(fā)現(xiàn)其臨床特點,聚焦和明確臨床定位。
(2)基于中醫(yī)理論,應(yīng)用現(xiàn)代研究首段,闡明藥物干預(yù)原理,為臨床應(yīng)用提供明確的理論和實驗依據(jù)。
(3)進一步明確患者獲益。
(4)指導(dǎo)臨床實踐、實現(xiàn)更加精準用藥,提高臨床療效。
4經(jīng)濟價值
中藥大品種二次開發(fā)研究,可促進形成產(chǎn)品品牌,帶動全產(chǎn)業(yè)鏈的發(fā)展,從而創(chuàng)造出重大的經(jīng)濟效益和社會效益。
二、中藥大品種受眾群體分析及二次開發(fā)研究目的
1.中藥大品種受眾群體分析
見圖2.
圖2 中藥大品種受眾群體分析圖
2.中藥大品種二次開發(fā)目的及對策
(1)為市場營銷、臨床醫(yī)生用藥以及患者消費提供理論依據(jù)和實驗證據(jù)
①以大品種為載體系統(tǒng)闡釋中藥的疾病干預(yù)原理、作用的特點、臨床優(yōu)勢以及組方配伍的科學(xué)內(nèi)涵。
②明確其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機理。
③發(fā)掘該品種的臨床價值,進一步聚焦臨床定位,指導(dǎo)臨床應(yīng)用,提高臨床療效。
④發(fā)現(xiàn)和提煉與同類產(chǎn)品的比較優(yōu)勢,增強其與同類品種的競爭力。提供市場拓展的理論與實驗題材,提高市場占有率。
(2)建立大品種技術(shù)群系,全面提升該產(chǎn)品的科技含量
①建立符合中藥特點的評價方法。
②建立有效的質(zhì)量控制方法,全面提升質(zhì)量標準。
③形成具有自主知識產(chǎn)權(quán)的技術(shù)群系,建立高端技術(shù)壁壘。
④促進企業(yè)技術(shù)升級。
(3)為開發(fā)換代產(chǎn)品提供研究證據(jù)
換代產(chǎn)品的研發(fā)也是中藥大品種二次開發(fā)研究的重要內(nèi)容,通過二次開發(fā)研究對中藥大品種的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機理、臨床特點和比較優(yōu)勢以及配伍規(guī)律等進行的系統(tǒng)的研究,在此基礎(chǔ)上,在通過處方優(yōu)化、工藝改進和劑型改進,開發(fā)形成換代升級產(chǎn)品。
三、中藥大品種價值品牌構(gòu)建
通過二次開發(fā)研究,構(gòu)建中藥的品種核心價值品牌。見圖3。
圖3 中藥大品種價值品牌構(gòu)建分析
四、中藥大品種二次開發(fā)研究主要內(nèi)容、方法和研究實例
中藥大品種二次開發(fā)研究主要包括五個方面的內(nèi)容:
(1)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究;
(2)作用機理研究;
(3)作用特點、配伍合理性及比較優(yōu)勢研究;
(4)質(zhì)量標準提升研究;
(5)組方優(yōu)化、工藝精簡及劑型改進研究。見圖4。
圖4 中藥大品種二次開發(fā)研究主要內(nèi)容示意圖
1.藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究
中藥的臨床功效的表達方式是中藥研究的核心內(nèi)容,而中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機理研究是揭示中藥的作用原理和臨床功效的表達方式的重要路徑。中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機理研究不但需要借助現(xiàn)代分析及化學(xué)生物學(xué)的研究方法,更重要的是必須依據(jù)中醫(yī)理論以及中醫(yī)藥對生命運動規(guī)律以及藥物干預(yù)途徑的基本認識,既“源于中醫(yī)藥理論”又要“回歸中醫(yī)藥理論”。
(1)疏風(fēng)解毒膠囊化學(xué)物質(zhì)組的表征和辨識
目前,疏風(fēng)解毒膠囊未見化學(xué)成分研究報道,本課題組對疏風(fēng)解毒膠囊的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)進行研究,通過HPLC-Q-TOF-MS/MS共識別了96個離子流色譜峰,分析確定了其中94個化合物:氨基酸7個,糖類1個,環(huán)烯醚萜類7個,苯乙醇苷類11個,二苯乙烯類1個,黃酮類24個,木脂素類6個,蒽醌類6個,三萜類18個,香豆素類1個,生物堿類5個,其他小分子化合物2個。對所有化合物分別進行了藥材來源歸屬,結(jié)果分別來源于處方中的虎杖(12個)、連翹(18個)、板藍根(14個)、柴胡(8個)、敗醬草(14個)、馬鞭草(11個)、蘆根(5個)、甘草(21個)。
(2)入血成分及其代謝產(chǎn)物的辨識
采用血清藥物化學(xué)的方法,運用UPLC-Q/TOF-MS結(jié)合代謝組學(xué)的方法,快速地分析和鑒定了口服給予元胡止痛方后大鼠血漿和腦組織中的吸收原型成分及其代謝產(chǎn)物。見圖5。
圖5 偏最小二乘判別分析模型:(A)得分圖;(B)載荷圖;(C)離子變量線圖
從口服給予元胡止痛滴丸后大鼠血漿中鑒定出40個與元胡止痛滴丸相關(guān)的外源性化學(xué)成分,包括26個原型成分和14個代謝產(chǎn)物。其中15個原型成分同樣在給藥組大鼠腦組織中被檢測到,表明它們能夠穿過血腦屏障滲透進入腦組織。在血漿尤其是腦組織中檢測到的吸收原型成分和代謝產(chǎn)物,可能是真正的活性成分并與元胡止痛方的藥理活性直接相關(guān)。這些將為元胡止痛方的藥理學(xué)和分子水平作用機制的進一步研究提供有用信息。
通過上述研究基本闡明了元胡止痛滴丸的化學(xué)物質(zhì)組、入血成分及其代謝產(chǎn)物。
(3)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的篩選和確認
①基于核心藥效學(xué)指標的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的確認-抗炎藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的篩選
采用UPLC/Q-TOF-MS整合NF-κB雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)的篩選體系,快速準確地篩選鑒定疏風(fēng)解毒膠囊中潛在的抗炎活性成分,明確其抗炎藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。通過活性篩選實驗,確定了10個活性單體,按照結(jié)構(gòu)類型分類,主要有苯乙醇苷類(連翹酯苷E、連翹酯苷A、異連翹酯苷A、毛蕊花糖苷)、環(huán)烯醚萜苷類(戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷)、木脂素類(連翹苷)、黃酮類(3-羥基光甘草酚、牡荊苷)和蒽醌類(大黃素)化合物。見圖6。
(A: 254nm下紫外譜圖;B: 正模式質(zhì)譜圖;C: 負模式質(zhì)譜圖;D: NF-κB抑制率圖)
圖6 疏風(fēng)解毒膠囊UPLC/Q-TOF及生物活性分析
以原代小鼠腹腔巨噬細胞為研究對象,對篩選結(jié)果進行驗證試驗。建立了LPS誘導(dǎo)的炎癥模型,在體外細胞水平上評價馬鞭草苷、連翹酯苷A、連翹苷、牡荊苷、大黃素五個單體化合物的抗炎效果。結(jié)果表明,五個化合物的干預(yù)能顯著地抑制原代小鼠腹腔巨噬細胞中LPS誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6的表達水平,并且呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系,驗證了五個單體化合物的抗炎效果。
②基于“性-效-物”三元論的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的表征和確認
a.基于味覺、嗅覺受體分子對接的“性(味)”物質(zhì)基礎(chǔ)虛擬篩選和確定
基于藥物分子-味覺(嗅覺)受體結(jié)合理論,運用計算機虛擬篩選方法進行“性(味)”物質(zhì)基礎(chǔ)篩選。以延胡索和白芷代表性化合物為小分子配體庫,進行hTAS2R10苦味受體對接篩選,其結(jié)果與陽性配體奎寧的對接結(jié)果比較發(fā)現(xiàn),原小檗堿型的代表性化合物延胡索乙素與構(gòu)建的苦味受體hTAS2R10的親和力較強,而原托品堿類成分對接結(jié)果較差,故推測原小檗堿型化合物可能為延胡索藥材中的苦味成分。對接結(jié)果見圖7。
圖7 hTAS2R10與延胡索乙素(A)和原阿片堿(B)結(jié)合模式圖
以延胡索和白芷代表性化合物為小分子配體庫,進行OR7D4辛味受體對接篩選,其結(jié)果與陽性配體辣椒素對接打分比較發(fā)現(xiàn),延胡索乙素、原阿片堿、歐前胡素與OR7D4的對接得分均高于辣椒素,初步推測其可能為辛味物質(zhì)基礎(chǔ)。對接結(jié)果見圖8。
圖8 or7D4與歐前胡素(A)、延胡索乙素(B)和原阿片堿(C)結(jié)合模式圖
b.基于G蛋白偶聯(lián)受體“功效五味”的物質(zhì)基礎(chǔ)篩選和確定
中藥的“五味”具有功效的內(nèi)涵,如辛“能散、能行”,甘“能補、能緩、能和”,酸“能收、能澀”,苦“能泄、能燥、能堅”,咸“能下、能軟”。并與四氣、升降浮沉、歸經(jīng)等藥性理論存在復(fù)雜的內(nèi)在聯(lián)系。
G蛋白偶聯(lián)受體是一大類膜蛋白受體的統(tǒng)稱。這類受體參與了很多細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。在這些過程中,G蛋白偶聯(lián)受體能結(jié)合細胞周圍環(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)并激活細胞內(nèi)的一系列信號通路,最終引起細胞狀態(tài)的改變。與G蛋白偶聯(lián)受體相關(guān)的疾病為數(shù)眾多,并且大約40%的現(xiàn)代藥物都以G蛋白偶聯(lián)受體作為靶點。應(yīng)用胞內(nèi)鈣離子濃度變化熒光技術(shù),對延胡索、白芷藥材及其主要成分進行G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合實驗,結(jié)果見圖9。
圖9 延胡索、原阿片堿、巴馬汀及延胡索乙素對6個GPCRs受體的激動和拮抗作用
結(jié)果表明:延胡索、白芷藥材均可作用于多個相關(guān)功能受體,且二者配伍后效果優(yōu)于單一給藥;原小檗堿類延胡索乙素和原阿片堿類原阿片堿可作用于與辛、苦味相關(guān)的功能受體,故可能為辛、苦味物質(zhì)基礎(chǔ);香豆素類歐前胡素可拮抗血栓素受體,體現(xiàn)了辛味活血化瘀的功效,其可能為辛味成分。延胡索和白芷配伍后可以通過激活5-HT1A、OPRM1、ADRB2受體,抑制D2、M2和TP受體來調(diào)節(jié)一系列的下游生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng),從而發(fā)揮多種生物活性,產(chǎn)生增效作用。延胡索乙素和歐前胡素配伍后可以通過激活A(yù)DRB2受體,抑制D2和TP受體來調(diào)節(jié)下游生物信號通路,從而發(fā)揮多種生物活性,產(chǎn)生增效作用。
2.作用機理研究
(1)整體動物模型—疏風(fēng)解毒膠囊解熱作用研究
采用酵母致大鼠發(fā)熱模型,研究疏風(fēng)解毒膠囊解熱作用,結(jié)果顯示,造模后5h、6h,模型組與對照組比較,體溫顯著性升高,說明造模成功。結(jié)果顯示,造模后5h,模型組與對照比較,大鼠肛溫有非常顯著性的升高,說明造模成功。與模型組比較,疏風(fēng)解毒膠囊高、低劑量組大鼠肛溫有顯著性的降低,表明疏風(fēng)解毒膠囊有顯著的解熱作用。
采用酵母致大鼠發(fā)熱模型,研究疏風(fēng)解毒膠囊給藥后對體溫調(diào)節(jié)相關(guān)因子IL -1α、IL-1β、TNF-α、IFN-γ、PGE2、cAMP、cGMP、Na-K-ATPase、IL-6、AVP的影響。結(jié)果:疏風(fēng)解毒膠囊能顯著降低炎癥因子PGE2及細胞因子TNF-α、IL-6、IL -1α、IL-1β水平,顯著降低致熱介質(zhì)cAMP及cAMP/cGMP水平,顯著降低Na-K-ATPase,減少產(chǎn)熱,顯著升高內(nèi)源性解熱介質(zhì)AVP的含量。疏風(fēng)解毒膠囊抑制PGE2、TNF-α作用弱于阿司匹林,增加AVP、cAMP/cGMP作用強于阿司匹林。結(jié)果表明疏風(fēng)解毒膠囊能顯著抑制炎癥因子PGE2產(chǎn)生,從而顯著抑制致熱性細胞因子TNF-α、IL -1α、IL-1β、IL-6的生成,進而減少產(chǎn)熱因子cAMP、Na-K-ATPase等含量,降低cAMP/cGMP,減少產(chǎn)熱,并使內(nèi)源性解熱介質(zhì)AVP含量增加,從而發(fā)揮其解熱作用。
(2)基于抗炎網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的作用機理研究
對篩選鑒定出的10個抗炎活性單體(連翹酯苷E、連翹酯苷A、異連翹酯苷A、毛蕊花糖苷、戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷、連翹苷、3-羥基光甘草酚、牡荊苷、大黃素)利用PharmMapper和KEGG等進行靶點及作用通路分析,結(jié)果表明,這10個成分可能通過HRAS、PDPK1等31個靶點作用于炎癥反應(yīng)的MAPK、VEGF等19條通路,這些信號通路與炎癥、膠原形成和肌肉收縮相關(guān)。利用Cytoscape 2.6軟件繪制疏風(fēng)解毒膠囊的抗炎網(wǎng)絡(luò)藥理圖(圖10)。
結(jié)果顯示,環(huán)烯醚萜苷類化合物馬鞭草苷和戟葉馬鞭草苷以及苯乙醇苷類化合物連翹酯苷A和毛蕊花糖苷通過與相應(yīng)的靶蛋白結(jié)合主要作用于和炎癥、免疫、膠原蛋白形成、肌肉收縮相關(guān)的信號通路,從而起到抗炎、免疫調(diào)節(jié)、和鎮(zhèn)咳的作用;木脂素類化合物連翹苷、黃酮類化合物牡荊苷、蒽醌類化合物大黃素主要作用于和炎癥以及免疫相關(guān)的通路而起到抗炎和免疫調(diào)節(jié)的作用;連翹酯苷E和3-羥基光甘草酚則主要通過作用于炎癥通路起到基礎(chǔ)抗炎的作用。由此推測,馬鞭草苷、戟葉馬鞭草苷、連翹酯苷A和毛蕊花糖苷是最重要的藥效物質(zhì)。
(3)對小鼠急性肺炎模型基因組學(xué)研究
通過對急性肺炎小鼠給藥前后基因組比較分析,疏風(fēng)解毒膠囊預(yù)給藥2周后,能顯著降低急性上呼吸道感染造成的IL-6、IL-8等炎癥因子的表達升高,減少肺粒細胞浸潤,改善肺部組織水腫、壞死脫落;基因芯片篩查結(jié)果(見圖11)顯示藥物干預(yù)組有70個基因與模型組有顯著差異,涉及84條作用通路。
圖11 疏風(fēng)解毒膠囊對急性肺炎小鼠基因表達譜的影響
(4)代謝組學(xué)研究
采用UPLC-Q-TOF-MS法,建立了大鼠原發(fā)性痛經(jīng)模型的代謝輪廓分析。復(fù)制腹腔注射縮宮素誘發(fā)大鼠痛經(jīng)模型,分離血清做PGF2α的生化檢測,血漿做UPLC-Q-TOF-MS的無靶向代謝組學(xué)分析。通過多元統(tǒng)計分析,從痛經(jīng)模型大鼠血漿中篩選出蘇氨酸、纈氨酸、磷酰膽堿、植物鞘氨醇、LPC18:3、LPC18:0等19個與大鼠痛經(jīng)模型有關(guān)的生物標記物。代謝通路分析表明,這些標記物主要存在于三條代謝通路中,分別為甘油磷脂代謝、氨基酸類代謝和鞘脂類代謝。
通過以上研究,基本明確了疏風(fēng)解毒膠囊的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),初步闡釋了疏風(fēng)解毒膠囊的作用機理,揭示了其多成分、多靶點、多途徑的網(wǎng)絡(luò)作用特點,對于詮釋中醫(yī)治肺理論有一定的借鑒意義,并為制定疏風(fēng)解毒膠囊質(zhì)量控制標準及臨床應(yīng)用提供了理論和實驗依據(jù)。
3.質(zhì)量標準提升研究
(1)基于藥材形成全過程的藥材質(zhì)量標準體系的建立
中藥原料藥材大多為來源于自然界的動植物有機體,與自然界存在千絲萬縷的聯(lián)系,并遵循生物遺傳和變異的基本規(guī)律。在藥材基原個體發(fā)育過程中,形成其質(zhì)量的基本內(nèi)容,因此,藥材質(zhì)量是由其種質(zhì)的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)及其個體發(fā)育過程中的生態(tài)(環(huán)境)歷程所決定的。藥材質(zhì)量的表達具有多維性和多重性的特點,既反映在形態(tài)和化學(xué)物質(zhì)組群等方面,又有藥效和藥性的兩方面的基本內(nèi)涵,并且,最終以方劑的形式在臨床上體現(xiàn)。
本文基于藥材形成的全過程,提出從藥材基原的形態(tài)統(tǒng)計學(xué)分析分類鑒定-藥材取樣-有效部位確定的藥效學(xué)研究-有效成分代謝及體內(nèi)過程研究-藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及質(zhì)量控制指標的確定-含量測定-指紋圖譜研究-譜效關(guān)系研究-質(zhì)量評價等質(zhì)量分析的全過程的中藥質(zhì)量分析技術(shù)方法和系統(tǒng)的評價體系,構(gòu)建中藥質(zhì)量分析規(guī)范性研究技術(shù),最終提出科學(xué)、規(guī)范、適合推廣應(yīng)用的技術(shù)方法和系統(tǒng)的評價體系(圖14)。
圖14 中藥材質(zhì)量研究及質(zhì)量標準建立技術(shù)體系
本項目對疏風(fēng)解毒膠囊原料藥材進行質(zhì)量標準提升研究。首先,對虎杖、連翹、板藍根、柴胡、敗醬草、馬鞭草、蘆根、甘草8味藥材進行了化學(xué)成分研究,通過液質(zhì)指認分析,確定了虎杖等藥材中共184個化合物;進一步建立了以上8味組成藥材HPLC指紋圖譜評價體系,通過系統(tǒng)聚類分析和相似度評價系統(tǒng)建立各個藥材對照指紋圖譜共有模式,對每個藥材的14批樣品采用指紋圖譜的方法進行質(zhì)量評價;建立了馬鞭草藥材中戟馬鞭草苷、馬鞭草苷、毛蕊花糖苷三個成分的含量測定方法,方法簡便、準確,重復(fù)性好。采用建立的方法對14批藥材進行了測定;并照中國藥典2010年版一部中虎杖、連翹、甘草、柴胡、板藍根的含量測定方法,測定了5味藥材共70批次的含量。對疏風(fēng)解毒膠囊原料藥材的質(zhì)量標準進行了全面的提升。
(2)復(fù)方中藥質(zhì)量控制模式的建立
中藥質(zhì)量控制及質(zhì)量標準的根本目的是對中藥的有效性、安全性及質(zhì)量的一致性進行有效的控制。因此,質(zhì)量控制指標與其安全性、有效性的關(guān)聯(lián)度至關(guān)重要。中藥成分復(fù)雜,各成分具有不同的生物活性,各成分之間在疾病生命系統(tǒng)中表現(xiàn)復(fù)雜的關(guān)聯(lián)規(guī)律,體現(xiàn)“多重藥理功效”特點,這也是中藥復(fù)方配伍原理和中藥干預(yù)疾病的特色和優(yōu)勢的核心所在。因此,建立復(fù)方中藥質(zhì)量控制的科學(xué)模式,首先要通過中藥化學(xué)物質(zhì)組與其生物效應(yīng)表達相關(guān)性研究,確定質(zhì)量控制的核心指標,進而以質(zhì)量要素完整性表達的技術(shù)方法建立系統(tǒng)、全面的質(zhì)量控制體系。見圖15。
本項目在對疏風(fēng)解毒膠囊藥效作用及作用機理研究、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究、血中移行成分研究、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究和有效成分體內(nèi)代謝研究的基礎(chǔ)上,確定質(zhì)量控制指標,建立了多指標成分含量測定方法和指紋圖譜方法,對該藥質(zhì)量標準進行全面提升。
圖15 復(fù)方中藥質(zhì)量研究模式
①疏風(fēng)解毒膠囊化學(xué)成分分析及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的確定
選用與疏風(fēng)解毒膠囊功能主治相吻合的體外抗炎藥理模型,對疏風(fēng)解毒膠囊指紋圖譜與體外抗炎藥效作用進行了有效成分分析及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究,結(jié)果表明其中10個色譜峰對應(yīng)的化學(xué)成分對NF-κB表達有顯著的抑制作用,通過HPLC/MS進行指認,確定了10個色譜峰對應(yīng)的化學(xué)成分為連翹酯苷E、戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷、連翹酯苷A、毛蕊花糖苷、異連翹酯苷A、連翹苷、3-羥基光甘草酚、牡荊苷、大黃素,這為確定疏風(fēng)解毒膠囊的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量控制研究提供參考依據(jù)。
②疏風(fēng)解毒膠囊多指標成分含量測定
依據(jù)篩選鑒定疏風(fēng)解毒膠囊中潛在的抗炎活性成分,明確其抗炎藥效物質(zhì)基礎(chǔ)主要有苯乙醇苷類(連翹酯苷E、連翹酯苷A、異連翹酯苷A、毛蕊花糖苷)、環(huán)烯醚萜苷類(戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷)、木脂素類(連翹苷)、黃酮類(3-羥基光甘草酚、牡荊苷)和蒽醌類(大黃素)化合物。在此基礎(chǔ)上建立了疏風(fēng)解毒膠囊HPLC多指標成分含量測定的方法,在同一色譜條件下同時測定虎杖苷、大黃素、連翹酯苷A、戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷、毛蕊花糖苷、甘草酸7個有效成分種成分的方法,該方法簡便、快捷、重復(fù)性好、可同時測定7種成分。建立了基于“有效性”的本品定量控制標準,以保證本品的有效性及其穩(wěn)定均一性。為本品質(zhì)量控制提供了保障。對近年的14批疏風(fēng)解毒膠囊中的7種成分進行了含量測定。
圖16 14批疏風(fēng)解毒膠囊中的7種主要成分含量測定結(jié)果
③疏風(fēng)解毒膠囊指紋圖譜研究
研究建立了疏風(fēng)解毒膠囊指紋圖譜質(zhì)量控制分析方法,采用所建立的方法對14批疏風(fēng)解毒膠囊樣品進行了指紋圖譜測定,采用相似度、聚類分析及主成分分析等數(shù)據(jù)處理方法對指紋圖譜的模式識別研究,確定22個共有峰,以21號峰為參照物峰,建立標準指紋圖譜(圖17)。
圖17 疏風(fēng)解毒膠囊HPLC標準指紋圖譜
通過疏風(fēng)解毒膠囊、全方藥材及相應(yīng)的陰性樣品指紋圖譜進行對照研究,對疏風(fēng)解毒膠囊HPLC指紋圖譜22個共有特征峰中的20個特征峰的來源進行了歸屬,其中來自于虎杖(8個)、連翹(6個)、馬鞭草(3個)、敗醬草(1個)、甘草(2個);通過采用對照品及采用HPLC-MS法對色譜峰進行了指認,分別為大黃酚、大黃素-8-O-葡萄糖苷、大黃酸、連翹酯苷E、戟馬鞭草苷、馬鞭草苷、虎杖苷、甘草苷、連翹酯苷A、羥基化連翹酯苷A、毛蕊花糖苷、異連翹酯苷A、白藜蘆醇、3-羥基光甘草酚、牡荊苷、Gancaonin G、異甘草苷、甘草素、芒柄花素、uralenol、大黃素、蘆薈大黃素。
綜上所述,本研究從質(zhì)量要素完整性表達及質(zhì)量控制全過程的角度,通過化學(xué)成分研究、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)控指標的確定、多指標含量測定、指紋圖譜等質(zhì)控手段和方法,建立了從藥材到成品的全過程的質(zhì)量控制體系,對疏風(fēng)解毒膠囊質(zhì)量標準進行了全面的提升。
4.組方特點、配伍合理性及比較優(yōu)勢研究
(1)組方特點、配伍合理性研究
①基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的元胡止痛滴丸配伍合理性研究
化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機理研究表明,元胡止痛滴丸對原發(fā)性痛經(jīng)具有明顯的鎮(zhèn)痛作用,其發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)為生物堿類和香豆素類成分。本部分采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法闡釋元胡止痛滴丸配伍合理性,選取元胡止痛滴丸中君藥延胡索藥材的生物堿類代表性成分延胡索乙素、巴馬汀、d-海罌粟堿和原阿片堿,及白芷藥材的兩個香豆素類代表性成分歐前胡素和異歐前胡素,進行潛在靶點和作用通路的預(yù)測,得到“化合物-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)藥理圖(圖18)。
通過分析試驗數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),以延胡索乙素、巴馬汀、海罌粟堿、原阿片堿為代表的生物堿類化合物可以單獨作用于與中樞鎮(zhèn)痛相關(guān)的9個蛋白靶點和9條信號通路,通過調(diào)節(jié)神經(jīng)鎮(zhèn)痛介質(zhì)而發(fā)揮治療痛經(jīng)的作用。以歐前胡素和異歐前胡素為代表的香豆素類成分可單獨作用于與性激素、炎癥以及痙攣關(guān)系密切的9個蛋白靶點和2條信號通路,通過調(diào)節(jié)性激素的分泌與釋放,抑制炎癥因子的表達,緩解平滑肌痙攣而起到治療原發(fā)性痛經(jīng)的作用。同時,6個化合物還共同作用于涉及免疫反應(yīng)、炎癥表達、平滑肌痙攣以及性激素調(diào)節(jié)等相關(guān)的5個蛋白靶點和8條信號通路。
(紅色圖形表示生物堿和香豆素共同作用的靶點及通路;黃色圖形表示生物堿單獨作用的靶點及通路;藍色表示香豆素單獨作用的靶點及通路)
圖18 元胡止痛滴丸代表成分網(wǎng)絡(luò)藥理圖
結(jié)果表明,元胡止痛滴丸中生物堿和香豆素兩類成分既有共同的作用靶點群及通路群,又各有偏重,作用通路涉及中樞鎮(zhèn)痛、激素調(diào)節(jié)、解痙、血管舒張、炎癥及免疫等各個環(huán)節(jié),各通路群間通過共有靶點連接,顯示出不同成分間的多靶點、多途徑的協(xié)同作用。
②基于鎮(zhèn)痛藥效學(xué)模型的元胡止痛滴丸配伍合理性研究
a.對小鼠熱板模型的影響:與模型組比較,元胡止痛滴丸可顯著延長藥后0.5h、1h、2h、3h熱刺激致小鼠舔足反應(yīng)的潛伏期,并可持續(xù)到藥后3h,延長率最高可達36.8%;延胡索提取物可顯著延長藥后0.5h、1h、2h熱刺激致小鼠舔足反應(yīng)的潛伏期,并可持續(xù)到藥后2h,延長率最高可達27.5%;白芷提取物對熱刺激致小鼠舔足反應(yīng)的潛伏期基本無影響。試驗結(jié)果表明,元胡止痛滴丸發(fā)揮中樞鎮(zhèn)痛作用的有效部位在延胡索提取物。采用金氏概率相加法計算Q值,結(jié)果顯示各時間點Q值均大于1,說明延胡索提取物和白芷提取物比例為2:1配伍對小鼠熱板反應(yīng)所致的疼痛潛伏期具有協(xié)同增效作用。
b.對小鼠醋酸扭體模型的影響:與模型組比較,元胡止痛滴丸、延胡索提取物和白芷提取物均可非常顯著的減少醋酸扭體反應(yīng)的扭體次數(shù),抑制率分別可達58.6%、34.3%、35.7%?梢娫雇吹瓮琛⒀雍魈崛∥、白芷提取物對化學(xué)刺激引起的疼痛均有明顯的鎮(zhèn)痛作用。采用金氏概率相加法計算Q值,結(jié)果顯示Q值大于1,說明延胡索提取物和白芷提取物比例為2:1配伍對小鼠扭體次數(shù)具有協(xié)同增效作用。
c.對大鼠痛經(jīng)模型的影響:與模型組比較,元胡止痛滴丸、延胡索提取物和白芷提取物能夠顯著延長痛經(jīng)模型大鼠扭體反應(yīng)的潛伏期,潛伏期延長率分別為73.3%、22.7%、39.8%。采用金氏概率相加法計算扭體反應(yīng)的潛伏期Q值,結(jié)果顯示Q值為1.370,說明延胡索提取物和白芷提取物比例為2:1配伍對縮宮素所致大鼠痛經(jīng)疼痛潛伏期具有協(xié)同增效作用。
與模型組比較,元胡止痛滴丸、延胡索提取物和白芷提取物能夠顯著減少扭體次數(shù),扭體次數(shù)抑制率分別為73.7%、53.7%、42.9%。采用金氏概率相加法計算扭體次數(shù)Q值,結(jié)果顯示Q值為1.002,說明延胡索提取物和白芷提取物比例為2:1配伍對縮宮素所致大鼠痛經(jīng)止痛具有協(xié)同增效作用。
與模型組比較,元胡止痛滴丸和延胡索提取物可顯著升高β-EP含量,顯著降低5-HT、NA含量,白芷提取物可顯著降低5-HT含量,對β-EP、NA含量基本無影響。采用金氏概率相加法計算血漿中β-EP、5-HT和NA 的Q值,Q值分別為1.30、0.79、1.17,說明延胡索提取物和白芷提取物比例為2:1配伍對縮宮素所致大鼠痛經(jīng)模型血管活性物質(zhì)β-EP和NA具有協(xié)同增效作用。
元胡止痛滴丸和延胡索提取物可顯著降低PGF2α含量及PGF2α/ PGE2比值,顯著升高PGE2含量,白芷提取物對PGF2α、PGE2及PGF2α/ PGE2比值基本無影響。采用金氏概率相加法計算血漿中PGF2α、PGE2和PGF2α/ PGE2 Q值,Q值分別為0.96、1.22、0.93,說明延胡索提取物和白芷提取物比例為2:1配伍對縮宮素所致大鼠痛經(jīng)PGE2具有協(xié)同增效作用。
d.對未孕大鼠離體子宮平滑肌運動的影響
元胡止痛滴丸、延胡索提取物、白芷提取物均能明顯降低縮宮素或PGF2α引起子宮收縮的頻率、平均振幅和活動力,并呈現(xiàn)劑量依賴性。金氏概率相加法計算活動力Q值,表明延胡索和白芷提取物按2:1比例配伍對縮宮素或PGF2α引起的子宮收縮具有協(xié)同作用。
延胡索乙素、歐前胡素及兩者合用(1:1)均能明顯降低縮宮素或PGF2α引起子宮收縮的頻率和活動力,并呈現(xiàn)劑量依賴性。金氏概率相加法計算活動力Q值,表明二者按1:1比例配伍對縮宮素引起的子宮收縮具有協(xié)同作用。
e.對大鼠原代子宮平滑肌細胞鈣內(nèi)流的影響
延胡索提取物、白芷提取物及兩者合用對子宮平滑肌細胞Ca2+內(nèi)流的影響:各加藥組均能有效抑制細胞內(nèi)Ca2+增加,且兩者合用組的平均熒光強度增加最少,對Ca2+內(nèi)流的抑制作用最強,優(yōu)于延胡索提取物、白芷提取物單獨使用。
延胡索乙素、歐前胡素及兩者合用對子宮平滑肌細胞Ca2+內(nèi)流的影響:各給藥組能有效抑制細胞內(nèi)Ca2+增加,且延胡索乙素、歐前胡素合用組的平均熒光強度增加最少,對Ca2+內(nèi)流的抑制作用最強,優(yōu)于延胡索乙素、歐前胡素單獨使用。
元胡止痛滴丸、延胡素提取物、白芷提取物含藥血清對子宮平滑肌細胞Ca2+內(nèi)流的影響:藥血清能有效抑制細胞內(nèi)Ca2+增加,且元胡止痛滴丸含藥血清組的平均熒光強度增加最少,對Ca2+內(nèi)流的抑制作用最強,優(yōu)于延胡索提取物含藥血清、白芷提取物含藥血清單獨使用。
③基于G蛋白偶聯(lián)受體的元胡止痛滴丸配伍研究
本研究以6個GPCR受體(5-羥色胺受體,5-HT1A、阿片受體,OPRM1、β2腎上腺素受體,ADRB2、多巴胺受體,D2、乙酰膽堿受體,M2、和血栓素-前列腺素受體,TP)為研究對象,通過運用胞內(nèi)鈣離子熒光技術(shù)檢測延胡索藥材、白芷藥材、二者配伍給藥以及延胡索乙素、歐前胡素、二者配伍給藥后對5-HT1A、OPRM1和ADRB2受體的激動作用以及對D2、M2和TP受體的抑制作用,從而揭示元胡止痛滴丸的作用機制,并在功能受體層面探究元胡止痛滴丸的配伍合理性。
與空白對照組比較,延胡索和白芷藥材配伍給藥后可以激動5-HT1A、OPRM1、ADRB2受體,抑制D2、M2和TP受體,從而調(diào)節(jié)一系列的下游生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng),發(fā)揮多種生物活性,體現(xiàn)了二者配伍給藥的多靶點多途徑作用特點。并且二者配伍給藥后對5-HT1A、OPRM1、ADRB2受體的激活作用和對D2、M2和TP受體的抑制作用均明顯強于兩味藥材單獨給藥,且具有統(tǒng)計學(xué)差異,表明二者配伍后有顯著的增效作用。單體配伍實驗表明,延胡索乙素單獨給藥后可以激動ADRB2受體,拮抗D2和TP受體;歐前胡素可拮抗TP受體。而二者配伍后對ADRB2的激動作用以及對D2、TP受體的拮抗作用均顯著強于單獨給藥,體現(xiàn)配伍后的增效作用。
④基于藥代動力學(xué)的元胡止痛滴丸配伍合理性研究
與延胡索提取物單獨給藥相比,延胡索-白芷組方配伍后延胡索甲素、延胡索乙素及原阿片堿在大鼠體內(nèi)的吸收增加,達峰濃度Cmax和AUC0→∞均顯著升高;與白芷提取物單獨給藥相比,組方配伍后歐前胡素、異歐前胡素的達峰濃度有所降低,但吸收延緩、滯留時間延長。結(jié)果表明,延胡索與白芷配伍存在明顯的體內(nèi)動力學(xué)相互作用。見圖19。
與單獨給藥相比,延胡索-白芷組方配伍能顯著升高延胡索甲素、延胡索乙素和原阿片堿在腦組織中的達峰濃度,增加其腦組織分布量,同時延長歐前胡素和異歐前胡素在腦組織中的平均駐留時間。文獻報道延胡索甲素、延胡索乙素、原阿片堿、歐前胡素及異歐前胡素均不是P-gp的底物,結(jié)合血漿藥代研究結(jié)果分析,抑制體內(nèi)代謝酶活性而對藥物吸收過程的影響可能是引起延胡索與白芷配伍后各效應(yīng)成分腦組織分布改變的主要因素。見圖20。
總結(jié),本研究通過整合整體動物、器官水平、細胞、受體、藥代動力學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理等多角度的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),延胡索中的生物堿類成分可通過作用于中樞鎮(zhèn)痛相關(guān)蛋白、平滑肌相關(guān)受體蛋白以及血栓素、血管緊張素等靶點蛋白來調(diào)節(jié)下游生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,從而發(fā)揮止痛、理氣、活血等功效,起到君藥的作用。白芷藥材同樣可以通過與5-羥色胺、乙酰膽堿、前列腺素血栓素等受體結(jié)合,參與痙攣、炎癥等相關(guān)信號通路的調(diào)節(jié)與轉(zhuǎn)導(dǎo),從而發(fā)揮行氣血的功效,輔助君藥延胡索加強治療,起到臣藥作用,體現(xiàn)了二者配伍的合理性。
(2)藥效比較優(yōu)勢研究
選用小鼠熱板、小鼠醋酸扭體和大鼠痛經(jīng)模型,對元胡止痛滴丸與月月舒(痛經(jīng)寶顆粒)進行鎮(zhèn)痛作用對比研究,挖掘元胡止痛滴丸治療痛經(jīng)的臨床優(yōu)勢。
①小鼠熱板試驗:與模型組比較,元胡止痛滴丸可顯著延長藥后0.5h、1h、2h、3h熱刺激致小鼠舔足反應(yīng)的潛伏期,并可持續(xù)到藥后3h,延長率最高可達36.8%;月月舒在藥后1h、2h、3h可顯著延長熱刺激致小鼠舔足反應(yīng)的潛伏期,延長率最高可達33.6%。與陽性藥月月舒比較,元胡止痛滴丸在藥后0.5h的鎮(zhèn)痛作用優(yōu)于月月舒,表明元胡止痛滴丸具有起效早的特點。
②小鼠扭體試驗:與模型組比較,元胡止痛滴丸和月月舒均可非常顯著的減少醋酸扭體反應(yīng)的扭體次數(shù),抑制率分別可達58.6%、29.5%;與陽性藥月月舒比較,元胡止痛滴丸鎮(zhèn)痛作用優(yōu)于月月舒。
③大鼠痛經(jīng)試驗:與模型組比較,元胡止痛滴丸和月月舒能夠顯著延長痛經(jīng)模型大鼠扭體反應(yīng)的潛伏期,潛伏期延長率分別為73.3%、34.1%。與陽性藥月月舒比較,元胡止痛滴丸延長痛經(jīng)模型大鼠扭體反應(yīng)的潛伏期的作用優(yōu)于月月舒,表明元胡止痛滴丸具有起效早的特點。
與模型組比較,元胡止痛滴丸和月月舒能夠顯著減少扭體次數(shù),扭體次數(shù)抑制率分別為73.7%、46.3%。與陽性藥月月舒比較,元胡止痛滴丸減少扭體次數(shù)的作用優(yōu)于月月舒,表明元胡止痛滴丸治療痛經(jīng)的鎮(zhèn)痛強度優(yōu)于月月舒。
與模型組比較,元胡止痛滴丸和延胡索提取物可顯著升高β-EP含量,顯著降低5-HT、NA含量,與陽性藥月月舒比較,元胡止痛滴丸可顯著升高β-EP含量,顯著降低5-HT含量,表明元胡止痛滴丸具有治療痛經(jīng)作用靶點更全面的特點。
元胡止痛滴丸可顯著降低PGF2α含量及PGF2α/ PGE2比值,顯著升高PGE2含量,月月舒對PGF2α、PGE2及PGF2α/ PGE2比值基本無影響。與陽性藥月月舒比較,元胡止痛滴丸可顯著降低PGF2α含量及PGF2α/ PGE2比值,顯著升高PGE2含量,表明元胡止痛滴丸具有治療痛經(jīng)作用靶點更全面的特點。
作者介紹
張鐵軍,男,研究員,享受政府特貼專家,天津市授銜專家,全國優(yōu)秀科技工作者。
主要從事中藥新藥研究和中藥資源研究工作。
承擔(dān)國家項目15項;天津市項目12項;研制中藥新藥20余項;第一發(fā)明人申報專利50項,授權(quán)30項;主編著作8部、參編15部,發(fā)表論文170余篇。獲國家“八五”重大科技成果獎1項,國家科技進步一等獎1項,國家中醫(yī)藥管理局科技進步一等獎1項;天津市科技進步一等獎1項、二等獎2項等多項獎勵。
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